细胞生物学的发展篇1
关键词：情境；探究式；动物细胞融合；单克隆抗体
一、教学分析
“动物细胞融合和单克隆抗体”是人教版高中生物选修3《现代生物科技专题》的内容。传统课堂教学中一般以讲述的形式先对动物细胞融合部分进行授课，再学习单克隆抗体的制备。经过多年教学实践，笔者发现以上述形式开展教学，学生往往印象不深刻且很难深入理解和实际运用，其根源在于学生是知识的被动接受者。本课采用自主合作的启发式探究式的学习方式，将两个内容归结为一个探究单元：单克隆抗体的制备，让学生充当科学家，不断调整和完善，在自主构建单克隆抗体的制备过程中，理解动物细胞融合的概念、原理、方法和意义。
二、教学目标
1.知识目标
简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程；了解单克隆抗体在医学实践中的应用。
2.能力目标
通过讨论学习，培养学生自主学习、建构模型的能力及协作精神。
3.情感与价值观目标
认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系，并关注细胞工程研究的发展和应用前景。
三、教学过程
1.创设情境，导入新课
体检中，医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒呢？（出示抗乙肝病毒表面抗原检测试剂盒），它的核心成分是针对乙肝病毒的抗体。毒蛇咬伤怎么办？（出示抗蛇毒血清图片），它的主要成分也是抗体。那么如何制备抗体？
设计意图：结合实际生活经历分析，吸引学生眼球，激发学生的好奇心和求知欲。
2.回顾旧知，设问质疑
设疑：抗体由什么细胞产生？在什么情况下产生？抗体产生后，主要在哪里分布？
设计意图：通过以上三个问题，自然引出传统的抗体生产方法并理解其缺点，并找到与单克隆抗体制备的关联，将难点分解，促进单克隆抗体制备的学习。
3.自主学习，分享提高
设置“问题串”，引导学生自主学习。如何获得纯度高、特异性强、产量又高的抗体呢？（1）抗体由浆细胞产生，且一个浆细胞只能产生一种特异性抗体，这就满足了纯度高和特异性强的要求，如何达到高产量呢？（2）我们知道可以通过体外培养动物细胞获得细胞产物，那么我们能否通过培养浆细胞，进而获得大量抗体呢？为什么？（3）哪种细胞具有无限增殖的能力？（4）如何才能将两种细胞的特点结合起来？
设计意图：利用问题驱动学生阅读教材，可以有效避免学生学习的盲目性，提高自主获取知识的效率。
分享提高：学生毛遂自荐，鼓励学生在他人面前分享自己的成果。通过教师的引导，总结出单克隆抗体制备的基本原理：B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，通过培养，就可以得到一个杂交瘤细胞群，这就是一个杂交瘤细胞的克隆，由其分泌的抗体，即单克隆抗体。使学生对单克隆抗体的认识从感性上升到理性，将抽象概念具体化。
4.合作探究，绘流程图
手足口病严重威胁婴幼儿健康，其主要是由肠道病毒71型（EV71）引起的传染病。请大家来扮演生物学专家，共同模拟制备针对EV71的单克隆抗体。请同学们首先阅读教材相关内容，获取知识，然后小组进行讨论，设计并画出流程图解决实际生活
问题。
设计意图：将课堂交给学生，自主获取知识并运用。
引导学生分组展示，并分析自己小组讨论最终达成共识的流程图。组间交流，分析，互相评价，达成共识。
5.拓展升华，突破难点
教师：制备单克隆抗体，首先要做的就是诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。这就涉及动物细胞融合技术。简介动物细胞融合的概念、原理、特点、意义及方法。启发学生回顾旧知（植物体细胞杂交技术），提问：（1）诱导动物细胞融合的特有方法是什么？学生：灭火的病毒。（2）融合后的杂交瘤细胞具有什么特点？出现这种特点的根本原因是什么？从遗传物质角度突破重点。
小组合作学习：诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，培养液中会有哪几种细胞？为什么要进行两次筛选？小组质疑，师生互动解惑。通过小组讨论和教师播放动画启发（单克隆抗体制备动画中的免疫小鼠和诱导细胞融合两步骤）。学生最终明白：从小鼠脾脏中提取的B淋巴细胞有多种，诱导细胞融合后，出现了三种结果：未融合的细胞、融合的具有同种核的细胞及杂交瘤细胞，故而首先需要筛选出杂交瘤细胞。又由于杂交瘤细胞不止一种，故还需继续筛选。筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞后，就可以扩大培养了。这样一来，学生不但对两次筛选的目的有了深刻的理解，而且为后期探究筛选的方法也做了一定铺垫。
质疑问难：（1）如何从中筛选出杂交瘤细胞呢？教师提供资料：B淋巴细胞本身不能大量增殖而逐渐死亡；当培养基中加入氨基嘌呤后阻断D途径，骨髓瘤细胞无法增殖而死亡，存活下来的只有杂交瘤细胞。归纳总结：利用选择性培养基阻断骨髓瘤细胞的增殖。（2）如何筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞？引导学生回顾免疫调节知识，得出结论：用相应抗原检测。并利用生动形象的视频（播放两次筛选视频）促进学生深入理解。
6.前景展望，情感升华
学生自主阅读教材和课外搜集、了解单克隆抗体的应用前景。谈谈你对试管动物技术应用的展望：可用于诊断试剂、治疗疾病和运载药物（生物导弹）等。
设计意图：挖掘情感，促进兴趣迁移。
7.课堂小结，回归课题
对动物细胞融合和单克隆抗体的内容进行整理和分析，构建知识体系，回归教学目标。
四、教学反思
“动物细胞融合”和“单克隆抗体”都是本节课的教学重点，“单克隆抗体”是本节课的难点，概念生涩难懂，过程复杂抽象。若在这两个点上平均使力，势必使得难点剖析不深刻。而动物细胞融合又是单克隆抗体制备的基础，因此，笔者在教材素材和文本设计上大胆创新，通过学生模拟生物学专家构建流程图，将动物细胞融合内容贯穿于单克隆抗体制备过程，打破传统的由教师先讲解知识再画流程图的学习方式，从而为学生提供了足够的空间和思考交流时间，使学生真正成为课堂的主体。学案引导、小组合作、模拟探究、小组质疑、教师解惑的教学策略，成功地突破了重难点，形成了完整的知识体系并获得学习的愉悦感和成就感。
细胞生物学的发展篇2
细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发DNA损伤[3]。
细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。
一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展
哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和Moorhead等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cellsenescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。
二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想
细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。
三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值
哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。
四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法
科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。
五、正确认识事物的逻辑方法
细胞生物学的发展篇3
【关键词】肿瘤干细胞；筛选；耐药性
【中图分类号】R739.4【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0141-02
1结肠癌干细胞的筛选
1.1筛选方法
肿瘤干细胞是肿瘤研究中的一大难题，其中最困难的是如何从肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。目前，分离和纯化肿瘤干细胞的方法主要有三种，但各有各的优缺点。一是无血清培养形成细胞球，亦是富集肿瘤干细胞的方荧；二是荧光染料法，但此种方法有一定的局限性；三是表面标志分子筛选法，又可分为流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。这两种方法均利用肿瘤干细胞表面特异的标志分子与带有标志的抗体结合，从而使其与非肿瘤干细胞分离。
1.2筛选过程
采用干细胞球培养法筛选结肠癌干细胞时，要取生长状态良好的结肠癌细胞制成单细胞悬液并计数，取单个细胞放入肿瘤干细胞培养基中悬浮培养，每天晃动几次，防止细胞贴壁，待细胞球变大，亮度降低，结构变松散时用酶消化传代，取亲本及传代后细胞放入孔板中培养后，计算成球率。取生长状态良好的结肠癌干细胞球置于含有牛血清的中培养，观察细胞贴壁分化情况进行磁珠分选。磁珠分选后，采用流式细胞术检测分选后细胞中含有表面抗原分子细胞含量。为了检测结肠癌细胞形成的癌细胞克隆球的抗原分子蛋白表达情况，接种后第6天克隆细胞球被采用免疫荧光检测。将分选后的细胞分别接种于无血清培养基中，检测标记细胞的体外增殖能力。
1.3标志分子的功能及其在结肠癌干细胞筛选中的应用
筛选结肠癌干细胞的标志分子大部分根据其表达水平而定，但标志分子在肿瘤干细胞中的功能尚不清楚。尽管结肠癌一直被认为起源于肿瘤干细胞，但因缺乏可靠的生物学标记，直到最近这个假说才得以证实。表面抗原分子是第一个用于筛选结肠癌干细胞的表面标志分子，是维持肿瘤干细胞干性的重要分子。以表面抗原分子筛选所得到的结肠癌细胞经鉴定具有体内成瘤能力，然而有研究发现表面抗原分子和转移后的结肠癌细胞都具有体内成瘤能力，这使利用表面抗原分子筛选结肠癌干细胞令人质疑。因此，利用表面抗原分子来筛选肿瘤干细胞需进一步的验证。跨膜糖蛋白是另一个在肿瘤中运用广泛的筛选肿瘤干细胞的标志分子，也是第一个应用于判断肿瘤放射治疗疗效的干细胞标志分子根据跨膜糖蛋白的表达来判断肿瘤组织中肿瘤干细胞的密度，从而就能达到预测放射治疗的效果。研究发现肿瘤干细胞标志分子在诱导与维持细胞与基质之间的链接起着重要作用，同时也能增强肿瘤细胞在新环境的增殖能力。
2结肠癌干细胞的耐药性研究
2.1引起肿瘤干细胞产生耐药性的原因
恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗和放疗。其中化疗是最主要的治疗手段。但由于肿瘤干细胞可以产生耐药性，使得肿瘤可以对多种化疗药物产生耐受，最终导致化疗失败。导致肿瘤干细胞产生耐药性的主要原因有以下几点。一是高表达转运蛋白可以参与多种跨膜转运过程，将糖类、脂类、氨基酸及细胞毒性药物等大分子物质逆浓度梯度转运到细胞外；二是肿瘤干细胞通常很少处于细胞生长的增殖期，当其收到一定刺激时会重新进入有丝分裂期，造成肿瘤复发；三是临床上常用的化疗药物的作用机制之一是诱导细胞凋亡，而肿瘤干细胞内细胞凋亡受到抑制，对这类化疗药物不敏感；另外，化疗药物的作用靶点通常是DNA，而肿瘤干细胞内的多种酶可以促进DNA的损坏修复功能，使肿瘤干细胞无法收到这类药物的作用。
2.2肿瘤干细胞的耐药性实验及结论
可靠的肿瘤干细胞筛选将为肿瘤干细胞干性及分化信号通路调节机制研究奠定基础。经实验证实，结癌干细胞对传统化学治疗药物比一般的肿瘤细胞具有更强的耐受性。处于静止期或慢周期状态是成体干细胞的一个重要特点，研究表明肿瘤干细胞也大多处于静止状态，并参与了肿瘤的耐药、复发和转移。细胞周期检测发现干细胞中处于静止期的细胞要明显多于亲本细胞，一方面表明肿瘤干细胞与成体干细胞的相似性，另一方面也进一步解释了肿瘤干细胞对细胞周期特异性药物的耐药性。实验结果还显示了结肠癌干细胞富集与耐药的相关性。干细胞球细胞对不同药物的耐药性均明显高于亲本细胞，其中细胞处于静止期使细胞对药物周期特异性的耐药，而表达升高使细胞对不同种药物均耐受，表现出多药耐药性。结肠癌治疗多年后复发及远处转移都与残留的结肠癌干细胞有关。因此，肿瘤干细胞靶向治疗具有重要的研究前景。
2.3肿瘤干细胞的靶向治疗
目前肿瘤干细胞靶向治疗的原理就是利用其表面表达的标志分子开展的。通过组织芯片发现这种标志分子抗原在不同临床病理分期的结肠癌中均有表达。这表明碳末端抗原表位可作为潜在的分子靶点，而化疗药物就可特异性结合到这个靶点，继而靶向治疗结肠癌。在临床结肠癌的治疗方面，一些研究者发现细胞膜表面表达的膜蛋白可以作为直接靶向目标或间接介导凋亡诱导复合物的内部分化而杀死肿瘤细胞。目前结肠干细胞的表面标志仍然不明确，因此，是否存在其他亚群的结肠癌干细胞仍是科学研究的方向。随着研究的进一步深入，可能会出现更多结肠癌干细胞表面标记，使得更为精细和科学的结肠癌干细胞的分离、鉴定成为可能。
3结语
干细胞标志分子在结肠癌干细胞研究中的作用是不容置疑的，但是目前对肿瘤干细胞生物学特性的功能仍不清楚。由于结肠癌干细胞迄今缺乏高特异性生物标记，生物学特性复杂，要开展靶向治疗还有待探索。对结肠癌干细胞的深入研究，有可能会从全新的角度去阐明结肠癌发生、发展的机制，从而为结肠癌的诊断、治疗提供一种新的思路，具有无限的发展空间和深远的科学意义。
参考文献
[1]汪春良，夏良，孙玉岭，结肠癌患者术前外周静脉血CD133阳性细胞数量与血清癌胚抗原及肿瘤进展的关系，实用医学杂志，2008；
细胞生物学的发展篇4
论文关键词：生物技术；伦理问题；思考
21世纪是生命科学的世纪，生物技术的发展对人类和社会的影响深远。而生物技术引发的伦理问题，已成为世界的焦点议题。如何合理的应用生物技术造福人类和社会，是众多学者和科学家急需解决的问题。
一、现代生物技术研究的新进展
进入21世纪，生物技术正处于发展成熟阶段，生物技术的应用已经渗透到我们生活中许多与生物无关的角落。生物技术的发展至今已经揭示了许多生命现象的本质及其规律，但生命现象极其复杂，目前仍有许多课题有待深入研究和探索。目前在克隆、胚胎干细胞、转基因食品、人类基因组计划、组织工程等研究和实际应用等领域取得了成果。
（一）克隆技术。克隆原意是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因都是相同的。克隆技术首先用于动物，动物克隆就是通过无性繁殖方式，由动物细胞产生的遗传形状相同的动物个体。克隆羊多莉是首例克隆成功的动物。动物克隆为我们进一步揭示生命的奥妙及人类的自我认识展现了全新的视野。
（二）胚胎干细胞。干细胞是生物体在生长发育过程中起“主干”作用的高度未分化细胞，它具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞分为三大类：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞之所以全能，是指它可以分化成人体全部细胞类型，进而构建心、肝、肾、肺等多种组织和器官，最终发育成一个完整的个体。全能干细胞再进一步分裂、分化中又形成了各种多能干细胞。多能干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，但是却失去了发育成完整个体的能力。
（三）转基因食品。转基因食品是利用生物技术将某些生物的基因转移到其他物种中去，从而改造生物的遗传物质，使其在性质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或以这种生物为原料，加工出来的食品都被称为转基因食品。转基因食品在欧美应进入人们的日常生活中。有资料表明，在欧洲，玉米钻心虫每年要毁坏4000万吨玉米，占世界玉米总产量的7%，但是如果把分离出来的抗钻心虫基因植入玉米中去，就可培育出抗虫害的玉米，这种玉米就是转基因食品。
二、现代技术发展引发的伦理问题
（一）关于克隆人的争议。从“多莉”羊的克隆成功，待几年来其他克隆动物的尝试，克隆技术正不断发展。目前科学界把对人体的克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆。科学界和伦理界对治疗性克隆普遍支持。但生殖性克隆，即克隆完整的人则遭到很大的抵制。克隆人给伦理道德方面带来了巨大的冲击，对现有的社会关系、家庭结构造成了巨大的冲击。另外，克隆人的身份难以认定，使人伦关系发生模糊、混乱乃至颠倒，进而冲击传统的家庭观以及权利与义务观。
（二）胚盘干细胞研究中的生命伦理问题。由于胚盘干细胞的制备是离不开人类卵子、胚盘以及克隆技术的，而卵子与胚盘在一些不同的国家和宗教界被视为是生命的起源，与活着的婴儿没有什么不同，所以在许多国家是被严格禁止的。坚持认为可以用人类胚胎做实验的人认为：1、早期胚胎仅是一团细胞，尚难称其为人的一条生命，从胚泡内细胞培养成人的胚胎干细胞，并没有杀死细胞，只是改变细胞的命运；2、培养胚盘干细胞是用于治疗现在还无法治愈的组织坏死性疾病，让病人恢复健康，完全是合乎人类伦理道德。
（三）转基因食品的潜在危险。对转基因食品发展有两种态度：支持者极力宣传其带给人类充足的粮食和新型抗病虫策略；反对者则强调人为地用基因技术改变神武，会给人体健康和环境带来危害。基因表达调控是个复杂的生命现象。目前，人类对基因的活动实施了解还不够透彻，还没有十足的把握控制基因中组后的结果。1993年英国的一份报告列出了一些人们对于转基因食品应用的来努力方面的主要担忧：1、人类基因转入食品动物，如将人类基因因子与凝血的蛋白质的基因转入绵羊中；2、某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中，这可能触怒犹太人和穆斯林，列入将猪的基因转入绵羊；3、动物基因转入植物中，可能会引起一些素食者的特别关注。
三、现代生物技术发展存在的伦理问题对策
现代生物技术的飞速发展，引发诸多伦理问题，发人深思。为了促进生物技术的和谐发展，应采取相应对策和措施。科学预言，21世纪是生物技术发展的黄金时期，全国普及大众伦理学知识尤为重要，设置伦理学咨询机构，利用各种媒体宣传伦理学知识，增强大众的伦理学意识，提高全民族的整体伦理水平。同时，我们还应改变传统伦理观念，发展中国特色的生命伦理学。总体上，生命伦理学应和国际生命伦理学保持一致，但又要保持中国的特色。另外，培养生命伦理专业人才，解决人才匮乏的局面。生命伦理学的发展任道重远，生命伦理学人才匮乏问题需要解决，设置生命伦理学专业，加快专业人才培养规模势在必行，特别应注重研究生、博士生的培养。
细胞生物学的发展篇5
论文摘要:细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分,目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述,并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。
细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节,通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前,植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。
1植物细胞凋亡的一般特征
经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化,光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小,染色质凝集、断裂、趋边化,细胞器解体、消失,细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器)[3.4]。随着研究的深入,分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质dna在核小体连接部位断裂,其片段大小为200bp的倍数,经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的dna梯度(dnaladder),此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。
2细胞凋亡的检测方法
2.1细胞形态学观察法
苏木素-伊红(he)染色法:石蜡切片的he染色是组织形态学检测的常规方法,光学显微镜下细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布,表现在核染色质致密浓缩,核碎裂等。
(1)电子显微镜。电镜观察,凋亡细胞染色质固缩,常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体,初期细胞可见完整的细胞器,细胞膜完整,凋亡小体形成。目前一致认为,电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。
(2)荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理,可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、hoechst33258或hoechst33342、碘化丙啶(pi)、溴乙锭(eb)。前两种可分别进入活细胞和死细胞,而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光,正常细胞呈均匀荧光染色,而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。
2.2反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。
除了电镜能反映细胞膜完整性外,还可用染料排斥法,如台盼蓝、pi等。坏死细胞膜破损,被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整,不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此,此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上,磷脂酰丝氨酸基团(ps)位于胞内侧,而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧,以利于被吞噬。因此,磷脂酰丝氨酸基团位置的改变,可作为凋亡细胞的一个标志。
2.3反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
细胞凋亡过程中,dna有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
(1)琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取dna后,于含eb的琼脂糖凝胶中进行电泳,正常细胞dna呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带,系180～200bp左右的及多聚核小体的梯状dna条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。dna电泳法是判断细胞凋亡的经典方法.peg6000诱导的小麦叶片[7]、羟自由基诱导的烟草细胞[8]、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9]和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生pcd时均检测到dna梯状条带。
(2)流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
(3)原位末端标记法(insituend2labeling,isel)。通过dna多聚酶i把已标记的核苷酸结合到dna的单链断裂处,以寻找有无ap发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
(4)原位切口平移法(insitunicktranslation,is2nt)。利用dna多聚酶将核苷酸整合到ap细胞内断裂的dna3′羟基末端,同时水解5′末端,以修复dna。若用已标记的核苷酸,即可显示出有断裂dna的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中ap的观察。
(5)末端转移酶介导的缺口末端标记法(tdt2me2diatedx2dutpnickendlabeling,tunel)。末端转移酶(tdt)介导的x2dutp缺口标记法是目标原位检测ap最为敏感、快速、特异的方法,其具有广泛的应用前景。末端转移酶(tdt)可催化在dna片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应,即dna片段加尾。利用末端转移酶(tdt)将标记的脱氧核苷酸转移到dna缺口或3′羟基末端上,通常所用的核苷酸为dutp,标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。
(6)elisa法。对ap细胞内dna片段的检测还可用elisa法。悬浮细胞经裂解,高速离心去除核的成分后,取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板,反应后再加酶标抗dna抗体,若上清中含断裂的dna片段,则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。
3植物发育过程中的细胞凋亡
萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上,与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核dna的断裂都可以经常观察到,但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。
3.1导管的形成
导管是由排列有序的死亡的导管分子(trachearyelements,tes)构成。王雅清和崔克明[13]对杜仲木质部导管分化的研究证明,其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织,而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14].
3.2单性花的形成
许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞,在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡,从而最终形成单性花。
3.3大、小孢子的形成和发育
大多数种子植物中,大孢子母细胞减数分裂形成4个大孢子。仅有1个能发育成雌配子体,其余的3个大孢子退化。例如,蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子,这4个大孢子通常呈线型或t型排列,仅有1个能继续发育成雌配子体,其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明,其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15]。
3．3雌雄配子体的发育
植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中,原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中,珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].
3．4胚的发育
在胚性细胞分化和发育过程中,存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成,在胚的形成过程中,助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成,当胚发育到一定阶段,胚柄发生细胞凋亡,形态上表现为质壁分离,原生质体固缩。单子叶植物的种子中,在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞,含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子,后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织,分泌水解酶,水解胚乳成分,种子萌发后,糊粉层功能完成,便开始凋亡,是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中,其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡,没有这些细胞凋亡,幼苗就不能正常生长发育,会因饥饿而死亡。
3.5根冠细胞的死亡
根冠位于根尖的顶部,是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中,根冠细胞不断脱落,并由顶端分生组织不断产生新的细胞,从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明,其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡,才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤,进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌d、秋水仙碱处理后,这些根尖分生组织细胞同样具有dnaladder、染色质和细胞核浓缩等特征,说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20]。
3.6叶发育过程中的细胞凋亡
在叶子的发育过程中,叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片)的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外,对叶片衰老过程的研究发现,衰老起始时,叶绿体首先被自体吞噬,此后水解酶、rna酶等活性上升,而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21],这些都是细胞凋亡的特征。因此,叶子脱落前叶片的衰老过程也是pcd。
4环境胁迫诱导的植物pcd
4.1植物超敏反应中的pcd
超敏反应(hypersensitiveresponsehr)是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应,其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中,dna片段化,特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。
4.2盐胁迫诱导的pcd
无机盐kcn、nacl、cacl2和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(nacl500mmol/l)处理后,出现明显的dna梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%peg溶液(-0.63mpa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片dna琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状dna条带，表明peg处理诱发了dna核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’oh末端标记法(tunel)检测出现阳性结果。
4.3活性氧与植物细胞凋亡
活性氧是一类具有强氧化能力的物质,主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等,各种逆境条件,包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(no)供体硝普钠(snp)处理小麦可以明显提高ros清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ros，或直接清除ros来保持细胞处于还原状态。
5研究植物细胞凋亡的意义及展望
导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶,形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前,细胞内物质可被其他细胞回收利用,这是植物能够独立营养的一个特性,叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果,但这个过程却影响了农产品的产量。因此,要搞清植物细胞凋亡的发生程序,对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中,被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式,从而限制感染部位病原菌的生长,阻止病原菌的传播,以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应,若在植物抗病育种中加以应用,使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染,就可以减少农药的使用,避免环境污染,从而提高人类生活质量。
由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短,同时由于细胞内各种因子相互作用,调控机制及其复杂,使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来,利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26],利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性,在细胞周期调控、dna复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用,在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究,为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。
随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入,发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚,植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的,但分子水平共同特征少,目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27]。研究过程中常局限于某一特定现象,很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来,加上植物生长周期较长,给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来,将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子,通过人为调控,改变生长发育期,提高果品产量和品质,则将会极大地推动果树现代化生产的发展。
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细胞生物学的发展篇6
【关键词】胚胎干细胞;临床医学;应用
【中图分类号】R817.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0123-01
一、引言
胚胎干细胞是一种存在于囊胚内的原始细胞团或存在于早期胚胎中的原始生殖细胞，在适当的条件下，它能够在体外进行无限次的扩增并保持未分化的状态。可以说，这是一种未分化的全能行细胞，它具有无限增殖性、多向分化性和可塑性等多种优良品质。人体正常的胚胎干细胞含有23对染色体，呈现出胞核大、胞浆小的形态特点，在体外培养时，它们会紧聚在一起，呈一个集落且没有明显的界线，通过适当的引导它可分化成人体所需各种细胞类型。上个世纪末期，美国科学家从早期的胚胎中取出原始生殖细胞，建立了最早的人类胚胎干细胞体系，这成为了人类继“人类基因组计划”之后的又一个热门话题，极大的轰动了国际学术界，目前，胚胎学已经成为了一门基础的医学课程。
从表面看去胚胎学与临床医学之间关系不大，但研究发展，许多疾病都发生在细胞层面、组织层面和分子层面，也就是说胚胎干细胞与临床医学息息相关。随着科学技术的进步，人类的认知能力会越来越强，胚胎学也将发挥越来越重要的作用。那么胚胎干细胞是怎么发展起来的呢，它到底又有什么样的发展前景呢，为此，本文在前人工作的基础上总结了胚胎干细胞的发展过程和临床应用研究。
二、胚胎干细胞的研究进展
人们对胚胎干细胞的研究开始于胚胎癌细胞或者说畸形胎瘤干细胞。1958年，有人把胚胎干细胞移植到小鼠精巢或肾脏的被膜下，能够得到小鼠的相应细胞。1974年，科学家把胚胎干细胞注射到正在发育的胚泡腔后，胚胎干细胞能够发育成胚胎嵌合体。到了70年代末期，人们已经形成了用正常的胚胎干细胞作为遗传物质载体来研究基因对胚胎发育影响的思想。
1981年哺乳动物胚胎干细胞研究进入了它的新纪元时代，这年科学家利用小白鼠胚胎，在体外培养分离出了其干细胞并建立了类胚胎干细胞。在随后的7~8年里，科学家相继用延迟着床的办法建立了仓鼠、兔、羊、猪、牛以及水貂的类胚胎干细胞。1994年，美国科学家分离得到了人类的传2代胚胎干细胞。1998年，科学家用类似的方法分离并克隆出了可以传32代的人类胚胎干细胞，在这研究过程中科学家成功完成了人类胚胎干细胞的冷冻和解冻实验，该项研究成果被美国时代杂志评为上世纪九十年代“世界十大科技进展”之首。
本世纪初，美国科学家卡茨和赫德里克研究培养出了成体干细胞。这种细胞是由从人的大腿或臀部抽取少量脂肪和液体培养而来，它们能够在适当的引导条件下发育成健康的肌肉、骨细胞和软骨，保持了胚胎干细胞发育成各种组织和器官的全能性。这一成果有可能使脂肪组织成为干细胞的主要来源，解决了科学家必须从骨髓或胚胎组织中提取干细胞的难题。
三、胚胎干细胞的临床应用
胚胎干细胞具有良好的自我更新功能，在给予合适的信号诱导或在适当的外界条件下，它可以分化成构建人体的不同细胞，用这类细胞分化成的特定器官进行移植时，排除了免疫排斥过程。所以说，胚胎干细胞作为一种“种子细胞”一定会在临床应用中有重要的应用，目前，应用最多最成熟的还是自体干细胞移植。
有了自体干细胞移植，在病床上躺了三个月的35岁的李先生又重新站了起来。今年上半年，李先生因交通事故，造成第四、第五胸椎粉碎性骨折，神经中枢受损，导致双侧以下失去感觉，大小便失禁，肌肉萎缩，下肢瘫痪。检查表明脊髓呈横贯性损害，医生决定为李先生进行自体骨髓干细胞移植。手术一月后患者的身体感觉平面已经恢复到了膝关节，三个月后下肢肢体触觉全部恢复，在搀扶下可站立10多分钟，并能借助轮椅自理生活。
3.1用于治疗遗传病、癌症等疾病
癌症、遗传病是人类目前最严重的医学难题，发生这些疾病是因为细胞在转化和分化的过程中出现异常。胚胎干细胞技术的出现为弄清细胞分化、发育过程，更深刻的了解细胞分化的奥秘提供了方法，为治疗上述疾病提供了崭新的手段和可能性。科学家已利用胚胎干细胞制造出许多小鼠的疾病模型，并使人的致病基因在小鼠体内表达，为下一步治疗人类疾病奠定了坚实的基础。美国国家神经病研究所分子学实验室用小鼠胚胎干细胞诱导神经上皮细胞，植入脑内得到大量的小突状细胞和神经胶质细胞，设想可用来治疗多发性硬化症。
3.2用于器官组织移植
作为一种被称之为种子细胞的胚胎干细胞，为临床的组织，器官移植提供大量材料。胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。美国ACT公司将人皮肤细胞核移植到去除所有遗传信息的牛卵母细胞中，培育出具全能性的胚胎干细胞。如果能将其成功地应用于临床，将来许多疑难疾病都将得到根治，对其他若干疾病也有理想的治疗效果。
3.3用于新药研制和开发
应用胚胎干细胞研究可以大大改变研发药品及其安全性检验。因为从理论上讲胚胎干细胞可以在体外培养出人体的210种不同类型的细胞。故可以对不同药物进行不同细胞类型的细胞水平的致畸形实验和药物筛选，使药品研制过程更趋合理有效并避免消耗大量实验动物。如应用胚胎干细胞培养成大量心肌细胞，将有助于心脏病药物的开发等。此外，胚胎干细胞还将用于出生缺陷、不孕、流产的控制与检测等方面。
四、结语
展望本世纪，生物医学工程将是一个被高度发展的世纪，现在人们意识不到的许多事件都将会出现在人们的面前，如生物经济将取代目前的网络经济。胚胎干细胞技术的应用价值不可估量，目前，其已成为了各国研究焦点之一。不过，从胚胎干细胞研究到实际临床应用之间还会有很长的一段路要走。
胚胎干细胞研究不是一个潮头，它将是一个巨大的推动力，推动着生物医学深刻革命，给人类带来更多的福音!到那时，如人们的某组织器官失灵了，完全可以像更换机器零件那样，用自身的成体干细胞定向诱导分化形成的组织器官替代失灵器官，而不担心供体不足的问题，更不用担惊受怕移植排斥的问题。
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